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Cell Death & Differentiation:口腔鱗狀細胞癌中circUHRF1促癌機制
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2019-10-08 | 1151 次瀏覽 | 分享到:

930日, Nature子刊Cell Death & Differentiation在線發表了一篇circRNA的研究文章,報道發現口腔鱗狀細胞癌中circUHRF1顯著高表達且具有促癌作用[1]。文章的通訊作者是天津醫科大學口腔醫學院的武杰Zihao Liu和首都醫科大學北京朝陽醫院的王左敏



文章作者通過挑選一些circRNA分子直接進行QPCR驗證的方式篩選發現了circUHRF1口腔鱗狀細胞癌(OSCC)細胞系中高表達。機制方面,作者發現circUHRF1通過競爭性結合miR-526b-5p正調控c-Mycc-Myc可促進TGF-β1ESRP1的表達,ESRP1可以通過結合circUHRF1的側翼內含子,促進circUHRF1的生成,最終形成一個正反饋的調控環路


1 OSCCcircUHRF1作用機制示意圖 ([1]

 

circUHRF1在口腔鱗狀細胞癌中表達顯著升高

作者通過檢索circBase數據庫篩選了一批候選circRNA,然后通過QPCR的方法驗證它們在OSCC細胞系中的表達情況,從中發現了circUHRF1circUHRF1UHRF1基因的12-13外顯子構成,QPCR結果顯示circUHRF1OSCC細胞系中顯著升高,臨床標本檢測結果表明高表達circUHRF1的患者預后更差。Sanger測序驗證了接口位置的序列,Actinomycin D處理表明circUHRF1UHRF1mRNA表達更穩定,RNase R消化處理表明circUHRF1是環形RNA分子。FISH實驗表明circUHRF1主要定位于細胞質中。


2 circUHRF1OSCC中高表達 ([1]

 

OSCC細胞中干擾circUHRF1抑制細胞增殖侵襲和EMT 

功能實驗表明,OSCC細胞中干擾circUHRF1可顯著抑制細胞增殖,遷移侵襲,也可抑制EMT過程。


3 OSCC中干擾circUHRF1抑制細胞增殖侵襲和EMT [1]

 

circUHRF1競爭性結合miR-526b-5p 

通過CircInteractome工具預測,作者發現了circUHRF1有可能與miR-526b-5p結合。Luciferase報告基因實驗,RNA pull-down實驗表明了circUHRF1可以競爭性結合miR-526b-5pFISH共定位實驗進一步確認了兩者的相互作用。QPCR顯示干擾circUHRF1可促進miR-526b-5p的表達豐度升高。


4 circUHRF1競爭性結合miR-526b-5p [1]

 

c-MyccircUHRF1/miR-526b-5p調控的下游基因

序列分析顯示c-Myc基因的3’-UTR存在miR-526b-5p的結合位點,構建Luciferase報告基因后顯示,干擾circUHRF1后能顯著抑制報告基因的表達,但相關序列突變后就不再有這一變化。Western實驗也證明干擾circUHRF1c-Myc的表達豐度會下調。


5 c-MyccircUHRF1/miR-526b-5p調控的下游基因 ([1]

 

c-Myc調控TGF-β1ESRP1的轉錄表達 

預測分析結果顯示TGF-β1ESRP1基因的啟動子區均存在c-Myc的結合位點(由JASPARRegRNA工具預測完成)。ChIP-PCRLuciferas報告基因實驗驗證了所預測的結果。


6 c-Myc調控TGF-β1ESRP1的轉錄表達 ([1]

 

ESRP1調控circUHRF1的生成

ESRP1是一種RNA結合蛋白,通過序列預測分析,作者發現circUHRF1的側翼內含子中攜帶了ESRP1的結合位點,為分析ESRP1是否調控了circUHRF1的生成,作者通過構建模擬基因組的minigene報告系統進行了分析。設計了各種位點突變載體(詳見下圖A)。ChIP-PCR實驗表明相關位點突變后ESRP1結合的效率會大大降低。干擾ESRP1也會降低circUHRF1的生成效率。


7 ESRP1調控circUHRF1的生成 ([1]

 

OSCC細胞中circUHRF1/miR-526b-5p/c-Myc/TGF-β1/ESRP1反饋回路調控細胞侵襲 

從上述的實驗結果中可以勾勒出一個正反饋的調控回路:circUHRF1通過競爭性結合miR-526b-5p正調控c-Mycc-Myc促進TGF-β1ESRP1的表達,ESRP1通過結合circUHRF1的側翼內含子,促進circUHRF1的生成,最終形成一個正反饋的調控環路。為驗證這一反饋回路在OSCC中是否發揮作用,作者設計miR-526b-5pinhibitorcircUHRF1shRNAc-MycsiRNAESRP1的過表達這多個因素來分析該通路的功能。結果顯示circUHRF1/miR-526b-5p/c-Myc/TGF-β1/ESRP1反饋回路可調控OSCC細胞的侵襲。


8 circUHRF1/miR-526b-5p/c-Myc/TGF-β1/ESRP1反饋回路調控OSCC細胞的侵襲 ([1]

 

體內敲降circUHRF1抑制OSCC細胞成瘤 

分子機制分析完成后還需要在體內驗證circUHRF1的功能。作者通過構建穩定敲降circUHRF1的細胞系觀測皮下成瘤能力的變化。結果表明穩定敲降circUHRF1可明顯抑制體內成瘤的速度。


9 體內敲降circUHRF1抑制OSCC細胞成瘤 ([1]

 

總結

本文的故事比較傳統,但在OSCCcircRNA的研究并不多,本文的故事豐富了circRNA在不同腫瘤類型中的作用研究。本文還有個亮點就是找到了正反饋調控circUHRF1的回路,為探索疾病特異性circRNA表達狀態的機制提供了借鑒。

 

參考文獻

1. Zhao, W., et al., Splicing factor derived circular RNA circUHRF1 accelerates oral squamous cell carcinoma tumorigenesis via feedback loop. Cell Death Differ, 2019.


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