標題摘要內容

 技術前沿 

關于我們/About??
轉錄組測序結合RBP預測分析circRNA生成機制和功能
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-04-22 | 172 次瀏覽 | 分享到:
2020年3月19日,丹麥奧胡斯大學的Trine Line Hauge OkholmJakob Skou Pedersen為共同通訊作者在預印本雜志BioRxiv發表了一篇題為“Transcriptome-wide profiles of circular RNA and RNA binding protein interactions reveal effects on circular RNA biogenesis and cancer pathway expression”的文章,報道基于全轉錄組測序結果分析circRNA與與RNA結合蛋白(RBP)的相互作用情況,預測分析了調控調控circRNA的生成的RBP機制及其在癌癥發生發展中的作用([1])。




環狀RNA(circRNA)是一種共價閉合的RNA分子,通常由pre-mRNA反向剪接衍生而來。RNA結合蛋白(RBP)是與雙鏈或單鏈RNA結合的蛋白質。最近有研究表明RBP影響circRNA生命周期的全部過程,一些RBP還參與了circRNA的生成,如Quking(QKI)、FUS和HNRNPL等等。由于circRNA和RBP相互作用的例子少,對于這種互作的功能研究還不是很清楚。本篇文章闡述了circRNA與RBP相互作用的潛力以及RBP對circRNA功能的影響。


在HepG2和K562中,circRNA高表達且與RBP共定位

利用全轉錄組RNA-Seq數據集,在HepG2和K562中分別檢測到26,174和24,076個特有的circRNA。選取前1%,劃分了兩個高表達的circRNA組。評估RBP在兩組circRNA上結合的位置。結合位點大多數位于外顯子,內含子位點通常被剪接剔除,而與剪接位點邊緣結合的RBP可能參與pre-mRNA的剪接。RNA-Seq數據分析,免疫熒光成像對circRNA和RBP定位,結果表明94%的circRNA可以和RBP相互作用,并且共定位于亞細胞不同區室中。



KHSRP結合在circRNA側翼的內含子上并影響其生成

為了全面分析RBP是否參與circRNA的形成,檢測高表達circRNA、circRNA和線性外顯子(非環狀RNA上的外顯子)上的RBP結合位點,發現KHSRP結合位點在circRNA的兩側內含子富集,且高表達circRNA組富集最多。KHSRP定位于細胞核,因此假設KHSRP在細胞核中結合circRNA側翼的內含子,從而促進circRNA的生成。K562細胞中,敲低KHSRP會使circRNA表達下降,證實KHSRP參與circRNA的生成。



RBP結合位點在circRNA的外顯子上富集

HepG2和K562細胞中,檢測各區域RBP結合位點的豐度,circRNA上反向剪接的外顯子(BSJ circ-exon)>circRNA上外顯子(circ-exon)>線性外顯子。表示來源于circRNA的外顯子相比較于線性的外顯子富集更多的RBP結合位點。總體而言,RBP結合位點在circRNA的外顯子上富集,并且某些RBP優先結合circRNA。


circRNA與RBP的相互作用有細胞類型特異性

RBP結合位點的數量與構成circRNA外顯子的數量沒有顯著關系。對于同一circRNA,在不同的細胞系之間,RBP結合位點的豐度也會不同。例如,HepG2和K562中circGSE1的表達水平相似,但是K562的circGSE1富集RBP結合位點,而HepG2中的circGSE1并不富集RBP結合位點。此外,不同細胞系之間,結合到同一circRNA的RBP也有所不同。在HepG2中,只有一個RBP GRWD1可以與circCDYL結合,而在K562中,存在九種不同的RBP與之結合。


在這兩個細胞系中評估120個高表達的circRNA和34個RBP之間的相互作用,相同的circRNA-RBP互作不到15%。表明細胞類型特異性的circRNA-RBP互作是一種普遍現象。


HepG2中,circCDYL-RBP互作的調控機制

circRNA可以通過多種方式來調節RBP。例如,circRNA可以作為誘餌將RBP保留到特定的細胞間隔中、作為支架促進兩個或多個RBP之間的接觸,或者作為更大功能復合物中的一個單元。為了更深入了解circRNA對RBP的調控機制,選取circCDYL為對象做進一步研究。HepG2中使用siRNA敲低(knockdown,KD)circCDYL,QuantSeq測量mRNA的表達變化,KEGG通路分析表明,circCDYL KD激活了癌癥通路,特別是MAPK信號通路。RIP實驗證實circCDYL可以與IGF2BP1和GRWD1互作。


GRWD1是一種多功能蛋白,在癌細胞中過表達。GRWD1表達的升高負調控TP53,并促進腫瘤發生。因此,假設circCDYL充當GRWD1的海綿,調控GRWD1對靶基因的作用,包括TP53,從而抑制GRWD1的促癌作用。實驗結果顯示,circCDYL KD時大多數下調的基因在GRWD1 KD時上調,包括TP53,證實了circCDYL充當GRWD1海綿的假說。


IGF2BP1是一種轉錄后調節因子,通常被賦予致癌作用,可以與MAPK信號轉導途徑有關的基因相互作用并調節其表達。PLA2G2A是MAPK途徑的一部分,在結直腸癌中上調,并且與不良的臨床結果相關。PLA2G2A在IGF2BP1 KD時下調,而在circCDYL KD時,其豐度增加了19倍以上。表明circCDYL作為IGF2BP1海綿,抑制IGF2BP1對PLA2G2A的正調控,進而抑制MAPK通路,抑制癌癥。這兩個結果表明,circCDYL可以作為RBP的海綿來降低RBP對靶基因的調控。


在膀胱癌中,驗證circCDYL可以作為RBP的海綿來抑制癌癥

有報道顯示circCDYL在非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)患者中高表達,并且與良好的預后呈正相關。為此,假設在膀胱癌(BC)中,circCDYL作為RBP海綿來抑制癌癥。在BC的FL3細胞系中,使用RIP、pull down、WB和qRT-PCR 證實了circCDYL可以與IGF2BP1、 IGF2BP2和GRWD1互作,不同于HepG2,circCDYL-IGF2BP的互作最強。


IGF2BP1和IGF2BP2具有致癌作用,并正向調節各種癌基因的表達。UMCD3細胞中敲低circCDYL和RBP觀察癌癥特征。在circCDYL KD時,幾種增殖途徑上調,而免疫途徑則下調。在IGF2BP1 KD時,增殖途徑被下調,免疫途徑被上調。證實circCDYL作為IGF2BP1的海綿,抑制IGF2BP1的致癌作用。最后,分析了一個本地患者隊列(n = 56)中circCDYL的表達及其臨床相關性。circCDYL的表達升高與良好的臨床結果相關。以上得出結論,circCDYL與BC細胞中的致癌RBP IGF2BP1和IGF2BP2相互作用,來調控癌癥。




參考文獻
1. Trine Line Hauge Okholm,Shashank Sathe,Samuel S. Park,et al. Transcriptome-wide profiles of circular RNA and RNA binding protein interactions reveal effects on circular RNA biogenesis and cancer pathway expression.bioRxiv,2020,https://doi.org/10.1101/2020.03.19.997478.
2018草小榴地址