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人工設計環狀RNA作為miRNA抑制劑治療心肌肥大
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-04-21 | 100 次瀏覽 | 分享到:
2020年4月4日,新加坡國立大學Matthew Ackers-JohnsonRoger S-Y Foo為共同通訊作者在Molecular Therapy預先發表了一篇題為“Engineered circular RNA sponges act as miRNA inhibitors to attenuate pressureoverload induced cardiac hypertrophy”的文章,闡述了一種針對心室肥大高效又穩定的新型治療策略,即人為構建可以靶向降解miR-132 / 212家族的circRNA海綿(circmiR),向心肌細胞遞送circmiR,使肥厚性疾病特征減弱,心功能得以穩定([1])。

心力衰竭是很多心血管疾病晚期的共同特征,它在全世界都有著高發病率和死亡率,并構成重大的醫療負擔,迫切需要新的治療方法。miRNA在正常發育和動態平衡中起著至關重要的作用,其失衡涉及各種疾病的發病機制。因此,靶向miRNA是一條可利用的治療途徑。circRNA的經典功能是作為miRNA海綿,如果circRNA作為藥物,可以解決半衰期短、脫靶效應和非代謝分子積累等傳統藥物缺點。



 1. circRNA海綿(circmiR)序列的設計


已知miR-132/212可以推動心臟病理性肥厚,設計可以降解miR-132/212的circRNA海綿(circmiR)。設計針對miR-132-3p完全匹配和不完全匹配的miRNA結合位點(MBS)。不完全匹配的MBS是不與miR-132-3p的9-12nt結合。設計的circRNA海綿交替與miR-132和miR-212結合,miRNA結合位點之間有6個核苷酸(nt)的裂縫,即不與miRNA結合的區域。為了使circRNA海綿環化,在它的兩側添加較長的反向互補內含子,使用發散引物的實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測circmiR的頭尾連接,并通過Sanger測序進行了驗證。



圖1 circmiR的設計和驗證


 2.
circmiR的功能測試與優化

使用雙螢光素酶報告基因實驗,證實設計的MBS對miR-132和miR-212有抑制作用。接下來,通過測試MBS不同間隔區長度,結合類型和總數的海綿作用來優化circmiR結構。設計miRNA結合位點間隔為6、12、24、36和72核苷酸,并驗證它們對miR-132/212的抑制作用,12核苷酸的間隔顯示出最好的效果。設計不同長度的MBS,隨著MBS長度的增加,對miRNA的抑制作用在加強,12個核苷酸MBS達到峰值。檢測完全和不完全匹配MBS的抑制作用,結果表明不完全匹配MBS抑制作用更強。然而,完全匹配MBS可以被miRNA降解。以上實驗在大鼠的心肌細胞中執行,結果同上。得出一個最佳的circmiR,具有12個核苷酸間隔和12個核苷酸不完全匹配的MBS。


圖2 circmiR設計的優化


 3.
體內circmiR給藥可減輕小鼠TAC模型誘導的疾病

作者驗證了miR-132和miR-212在橫向主動脈縮窄(TAC)心臟超負荷小鼠模型中上調。在TAC處理前一周,腹腔注射腺病毒,使心肌細胞(CM)轉入circScram, circmiR和線性miR-132/212海綿,TAC處理后來觀察各組心臟的受損情況。circmiR和線性miR-132/212海綿組小鼠與circScram組小鼠比較,室間隔(IVS)和左室后壁(LVPW)的厚度薄、心臟功能得以保留并且病理性肥大明顯減輕。表明,circmiR具有與線性miR-132/212海綿一樣的功能,可以治療心臟功能受損。有趣的是,在circmiR和線性miR-132/212海綿組中miR-132和miR-212的豐度明顯更高。這可能是由于螯合的miRNA保留而沒有被降解引起的。


圖3 circmiR可以減輕心力衰竭


4.
體外檢測circmiR的療效及其穩定性

利用排列內含子-外顯子的方法在體外合成circmiR,順序是5’端內含子-外顯子1-miRNA海綿序列-外顯子2-3’端內含子。隨后,circmiR在體外轉錄和純化,與antagomir比較對miRNA的抑制效果。antagomir為miRNA拮抗劑,可以治療心肌肥厚,正在進行一期的臨床試驗。雙螢光素酶報告基因顯示,circmiR相比于antagomir和線性miRNA海綿,對miRNA的抑制更顯著。circmiR的療效是antagomir的兩倍。因此,體外試驗表明,合成的circmiR比antagomir療效更加顯著。


最后,證實circmiR的穩定性。HEK293T細胞轉染circmiR或線性miRNA海綿的表達質粒,轉染人工合成circmiR或線性miRNA海綿。用放線菌素D處理,在指定時間點測量兩者的表達量,繪制circmiR和線性miRNA海綿隨時間的變化圖。在處理72小時,不管是人工合成還是質粒表達的circmiR都未曾被降解,相比較于線性miRNA海綿有更好的穩定性。



圖4 人工合成circmiR及其療效
圖5  circmiR比較線性miRNA海綿更加穩定
參考文獻
1. Lavenniah A, Anh Luu TD, Li YP, Lim TB, Jiang J, Ackers-JohnsonM, S-Y Foo R, Engineered circular RNA sponges act as miRNA inhibitors to attenuate pressureoverload induced cardiac hypertrophy, Molecular Therapy (2020), doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2020.04.006.
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